神經(jīng)根慢性嵌壓損傷動物模型 

脊髓退行性病變等引起的神經(jīng)根嵌壓傷，是一個慢性損傷過程。其主要表現(xiàn)為椎間盤突出、關(guān)節(jié)突增生、黃韌帶肥厚等，繼之造成神經(jīng)根受壓，引起相應(yīng)癥狀。因此，建立接近神經(jīng)根在神經(jīng)通道內(nèi)受壓的動物模型，進(jìn)行各項研究指標(biāo)的觀測，有利于了解疾病的發(fā)生、發(fā)展及探索有效的臨床治療方法。現(xiàn)在已有大量動物模型用于研究神經(jīng)根受壓后的變化，常用的造模動物有狗、豬、家兔、大鼠等，施加壓迫所用的材料亦各不相同。

1 自身骨性增生法(caused by self-bone hyperplasia)

(1)復(fù)制方法

1)手術(shù)操作  健康家貓，體重為3～5kg，雌雄不拘。經(jīng)耳緣靜脈注射硫噴妥鈉(25mg/kg體重)麻醉后，俯臥位固定，剪除手術(shù)區(qū)域毛發(fā)，局部皮膚消毒，無菌操作。分別在下頸段和腰段做正中切口，顯露右側(cè)C7、C8、L5、L6神經(jīng)根及椎間孔內(nèi)口，用牙髓鉆破壞椎間孔周圍骨皮質(zhì)后，將咬除的棘突剪成3mm×10mm的骨條，在中間處對折呈“V’形骨塊，從椎間孔內(nèi)口向外，沿骨壁嵌于神經(jīng)根通道的骨性管道內(nèi)及側(cè)隱窩后方，左側(cè)做正常對照。術(shù)后給予抗感染治療3d(按每只2萬 U/d肌肉注射慶大霉素或按50mg/kg體重腹腔注射頭孢唑啉鈉)。觀察動物術(shù)后的一般情況、肢體運動和肌力狀態(tài)。

2)檢測內(nèi)容與方法

①影像學(xué)和MEP檢測  在造模術(shù)前和術(shù)后的2, 4, 8, 12, 24周將實驗動物于麻醉下行X光平片和CT檢查，以確定手術(shù)處神經(jīng)根通道的狹窄程度和神經(jīng)根受壓狀態(tài)。同時進(jìn)行MEP(磁刺激運動誘發(fā)電位檢測)檢測，刺激位點：脊髓點，C8～T1或L5～6棘突之間；周圍神經(jīng)叢點為ErB'S點，在T1棘突與同側(cè)前肢遠(yuǎn)端連線上，距T1棘突5cm處。接收電極置于相應(yīng)靶肌肉肌腹表面，接地電極置于刺激點與接收點之間。

②病理組織學(xué)檢查  動物在做神經(jīng)根病理取材時，需觀察神經(jīng)根受壓狀態(tài)和椎間孔大體形態(tài)。用游標(biāo)卡尺測量椎間孔截面積，并與對照側(cè)比較；HE染色在光鏡下觀察神經(jīng)纖維軸突、髓鞘、神經(jīng)膜細(xì)胞、神經(jīng)膜等的改變程度；碳酸鋰－蘇木素髓鞘特殊染色觀察髓鞘情況；透射電鏡觀察神經(jīng)纖維、髓鞘的超微結(jié)構(gòu)變化。

(2)模型特點

1)行為學(xué)癥狀及影像學(xué)和MEP檢測  術(shù)后2～5d動物實驗側(cè)肢體跛行，肢、腕和膝、踝呈屆曲位，不能負(fù)重，被動牽拉出現(xiàn)痛苦狀掙扎。10d后癥狀可減輕或消失，于4～6周上述癥狀再現(xiàn)。8周時出現(xiàn)不同程度的肌萎縮，對刺痛的躲避反射減弱。至12周時，部分動物肢體遠(yuǎn)端可出現(xiàn)潰瘍。 X光平片和CT檢查顯示，2周左右時，植入骨邊界清楚，神經(jīng)根管明顯較對側(cè)狹窄。隨著時間的推移，植入骨塊周邊密度降低，邊界模糊，椎間孔周圍骨皮質(zhì)密度增高，呈增生反應(yīng)。植入骨周圍及椎間孔處有骨痂形成，神經(jīng)根管狹窄。 MEP檢測顯示，隨著病情的進(jìn)展，出現(xiàn)脊髓刺激點和ErB's點誘發(fā)電位潛伏期延長，波幅降低，波形分化不清和雙峰波等異?，F(xiàn)象。

2)病理組織學(xué)檢查  ①HE染色顯示：隨著病程的進(jìn)展，表現(xiàn)為神經(jīng)束膜、內(nèi)膜水腫，部分髓鞘發(fā)生腫脹和無髓纖維變形。神經(jīng)外膜增厚，可發(fā)生節(jié)段性脫髓鞘改變。神經(jīng)纖維軸突發(fā)生節(jié)段性增粗、斷裂，遠(yuǎn)端發(fā)生勒瓦氏變性。隨后變性的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)崩解、吸收、形成空洞，增生的結(jié)締組織使整個神經(jīng)干纖維化。②髓鞘特殊染色顯示：隨著損傷程度的加重，染色由深藍(lán)變?yōu)榈S色，髓鞘變薄，數(shù)量減少。③透射電鏡顯示：髓鞘結(jié)構(gòu)變形，內(nèi)層向軸突內(nèi)突出。在受損髓鞘周圍，均可見增大的神經(jīng)膜細(xì)胞核，線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等明顯增殖。

(3)比較醫(yī)學(xué)  該模型采用椎間孔內(nèi)自體松質(zhì)骨植入，操作簡單、費用低廉、重復(fù)性好、成功率高。利用自體骨的增生和炎性粘連反應(yīng)在椎間孔內(nèi)和側(cè)隱窩處嵌壓神經(jīng)根，使損傷部位、形式和病理過程與臨床更為接近。同時，也避免了由于異物植入反應(yīng)對實驗結(jié)果造成的混雜因素。該模型的病理表現(xiàn)是一個漸進(jìn)的過程，由直接受壓處開始逐漸向遠(yuǎn)端發(fā)展，并引發(fā)周圍神經(jīng)的一系列改變，在同一神經(jīng)干中可并存幾種不同程度的損傷形式。無髓的感覺神經(jīng)纖維變性明顯早于有髓的運動神經(jīng)纖維，這與臨床神經(jīng)受壓先出現(xiàn)感覺障礙而后影響運動功能相吻合。其病理學(xué)的改變也顯示了神經(jīng)在慢性損傷過程中各階段的病理特征，可為相關(guān)實驗提供較可靠的動物模型。

該方法還可適用于脊髓各段神經(jīng)根造模，嵌壓范圍可按需把握。

2 腰骶神經(jīng)壓迫法(nerve lumbar-sacrum oppression)

常用的造模動物有狗、豬、家兔、大鼠等，施加壓迫所用的材料亦各不相同。下面綜合介紹幾種對不同動物腰骶神經(jīng)的慢性壓迫法。

(1)復(fù)制方法

1)狗  Delamarter等將粗2.8mm的尼龍電纜線套住狗的馬尾神經(jīng)，使硬脊膜囊縮窄50％～75％，產(chǎn)生馬尾神經(jīng)受壓的效果可持續(xù)壓迫數(shù)天～數(shù)個月。經(jīng)檢查皮質(zhì)誘發(fā)電位、微血管結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)方面的改變，認(rèn)為縮窄50％是關(guān)鍵，壓迫>50％時將出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙和組織學(xué)改變。 Yoshizawa暴露狗的第7腰神經(jīng)根2.5～2.8cm，將長5mm、內(nèi)徑3mm(比神經(jīng)根直徑稍粗)的硅膠管縱行切開套在神經(jīng)根上，用7～0的尼龍線捆扎套管。觀察放置套管后24h、14d、1個月、6個月和12個月神經(jīng)根的組織形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)及血－神經(jīng)屏障的變化。

此模型的病理機(jī)制與臨床具有相似性，硅膠管輕微活動引起的刺激破壞了神經(jīng)根血－神經(jīng)屏障，加上硅膠管內(nèi)圍繞神經(jīng)根產(chǎn)生的增生瘢痕，共同導(dǎo)致了神經(jīng)根內(nèi)水腫，前者是產(chǎn)生功能障礙的主要原因。

2)豬  豬的脊髓終止于第2骶椎水平。骶1背根神經(jīng)節(jié)一半位于神經(jīng)根管內(nèi)，另一半位于椎管內(nèi)，馬尾神經(jīng)和下位骶神經(jīng)根的脈管結(jié)構(gòu)與人相似。Cornefjord將原用于制作冠狀動脈慢性閉塞模型的Ameroid縮窄器套在豬的骶1神經(jīng)根周圍和背根神經(jīng)節(jié)的近端制作慢性壓迫模型。該縮窄器長5.5mm，外層為一剛性金屬殼，內(nèi)層為吸水后可膨脹的酪蛋白衍生物。觀察不同內(nèi)徑的縮窄器對神經(jīng)根引起的解剖形態(tài)及神經(jīng)生理學(xué)改變。認(rèn)為3.5mm為適內(nèi)徑，能逐漸縮小，3周后固定于3.0mm，可達(dá)到緩慢壓迫神經(jīng)根的目的。但神經(jīng)根所受的壓迫不是直接由縮窄器自身產(chǎn)生，而是因術(shù)中的積血在神經(jīng)根周圍形成肉芽組織機(jī)化為瘢痕，瘢痕組織對神經(jīng)根產(chǎn)生直接壓迫效應(yīng)。

該模型的優(yōu)點是能使壓迫漸進(jìn)發(fā)生，具有重復(fù)性和可控性，可產(chǎn)生慢性不性神經(jīng)根損傷。

3)兔  兔的脊髓圓錐位于L7～S1水平。Toh特制了長度為20mm的“H”型不銹鋼金屬夾，將頂部和底部的空缺用來放置S2和S3的棘突，橫形的中間部有一直徑為3mm的可調(diào)旋鈕，用來壓迫兔腰骶部馬尾區(qū)的硬膜囊和神經(jīng)根。壓迫可分3級，通過X線攝片進(jìn)行調(diào)整：1級，旋鈕插入椎管前后直徑的1/9；2級，插入2/9；3級，插入1/3。壓迫可在1個月內(nèi)一次完成，也可在1個月與2個月后漸進(jìn)增加壓迫級別完成。

該裝置為能通過腦脊液施加量化的神經(jīng)壓迫技術(shù)。

4)大鼠  大鼠經(jīng)濟(jì)、易于管理、腰骶叢和人相似，是除狗、豬、兔等大動物以外的較為合適的實驗用小動物。

大鼠的脊髓終止于L3～4水平。學(xué)者們采用不同的材料壓迫腰骶神經(jīng)根，使之產(chǎn)生慢性壓迫癥狀。Kawakami將4根長0.3cm的4/0鉻制腸線放在實驗大鼠的腰4～6神經(jīng)根周圍，另用2根腸線松散環(huán)扎固定，對照組大鼠用2根4/0的絲線松環(huán)扎固定模型，觀察神經(jīng)根受激惹后不同時期(1, 2, 3, 4, 6, 8, 10和12周)的病理生理改變和行為變化。雖然鉻制腸線和絲線均可使粗髓纖維減少，出現(xiàn)相同組織學(xué)改變，但只有鉻制腸線組才出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象；周躍等改用骨蠟局部固定鉻制腸線，操作簡單、損傷小，具有壓迫止血作用，術(shù)后也出現(xiàn)了痛覺過敏表現(xiàn)；Yamaguchi將一厚0.3mm、面積為3.5mm2的約占椎管橫截面37％的聚硅酮薄片插入大鼠腰4椎管內(nèi)，覆蓋硬脊膜管的背側(cè)，制作腰椎管狹窄的實驗?zāi)Ｐ?。觀察馬尾神經(jīng)慢性受壓24周后形態(tài)和行為方面的改變，發(fā)現(xiàn)軸突存在持續(xù)的退變和再生現(xiàn)象；Yabuki取大鼠尾端的自體髓核，將其移至背根神經(jīng)節(jié)近端的L5神經(jīng)根處。對照組取同體積的自體肌肉組織以同樣的方法移至神經(jīng)根處，觀察大鼠背根神經(jīng)節(jié)和后爪血流的變化。發(fā)現(xiàn)髓核移植組背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)流體壓力增加，神經(jīng)根和后爪的血流量減少，肌肉移植組未發(fā)生血流量變化。由于背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)不存在血一神經(jīng)屏障，因而認(rèn)為其交感活性增強(qiáng)，出現(xiàn)異常興奮并通過軀體交感反射引起上述變化，是椎間盤突出引起根性疼痛發(fā)病的重要原因。

髓核自體移植可用于研究神經(jīng)根受壓時的炎性損傷效應(yīng)。

以上四種動物慢性壓迫模型尚存在下述缺點：①均須手術(shù)施行部分椎板切除，手術(shù)操作較復(fù)雜，局部創(chuàng)傷大，破壞周圍組織結(jié)構(gòu)。②對神經(jīng)根壓迫程度不易控制，難以量化。③與神經(jīng)根在神經(jīng)通道內(nèi)的壓迫不相符，臨床上壓迫緩慢發(fā)生，神經(jīng)根在神經(jīng)通道內(nèi)靠椎管內(nèi)的韌帶固定，當(dāng)其受到壓迫時，有的緩沖余地，程度和力量不斷變化。④存在機(jī)械、炎癥、流體力學(xué)等不同的混雜干擾因素。

(2)實驗觀察

1)組織形態(tài)學(xué)觀察

①光鏡觀察神經(jīng)慢性壓迫的早期表現(xiàn)為：神經(jīng)根的硬脊膜和蛛網(wǎng)膜變厚，神經(jīng)內(nèi)膜間隙明顯充血、水腫和出血，伴有部分神經(jīng)細(xì)胞腫脹、壞死和脫髓鞘樣改變，而神經(jīng)纖維尚未發(fā)生變性反應(yīng)；壓迫4周后，充血、出血和水腫明顯減輕，而以神經(jīng)纖維的脫髓鞘樣改變、纖維細(xì)胞增生為主，有明顯的炎癥反應(yīng)，神經(jīng)纖維發(fā)生明顯變性。主要表現(xiàn)為大直徑有髓纖維數(shù)量明顯減少，而小直徑無髓纖維數(shù)量相對增多，軸突的體積和髓鞘明顯萎縮，神經(jīng)外膜和神經(jīng)內(nèi)膜纖維化樣改變，膠原纖維明顯增多。

②電鏡觀察顯示：髓鞘板層結(jié)構(gòu)呈點狀松散，板層結(jié)構(gòu)排列疏松、紊亂和腫脹并擠突，軸突呈不規(guī)則樣改變，軸漿內(nèi)細(xì)胞器密集。血管通透性顯著增加，神經(jīng)膜細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體明顯腫脹，嵴排列紊亂和消失，呈空泡樣改變。核周粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，胞核呈顆粒樣改變，溶酶體多見，游離核糖體增多。胞漿內(nèi)含有較多的呈空泡樣改變的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和擴(kuò)張的高爾基扁平囊泡。細(xì)胞核膜出現(xiàn)“裂隙”樣改變。

2)電生理學(xué)檢測  壓迫3個月后，復(fù)合動作電位的振幅明顯降低，與早期粗有髓纖維數(shù)量的減少相一致；12個月后，復(fù)合動作電位的振幅和感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)速度都明顯下降。復(fù)合動作電位可靈敏反映神經(jīng)根變性時粗有髓神經(jīng)纖維的減少情況，但只要還存在粗有髓神經(jīng)纖維，神經(jīng)傳導(dǎo)速度就不會下降；脊髓誘發(fā)電位(SEP)的潛伏期(N1和P1波)明顯延長。用鉻制腸線炎性損傷后1周時潛伏期無顯著變化，2～4周后SEP的潛伏期明顯縮短，8周后延長。將刺激電極放在脛后神經(jīng)和正中神經(jīng)處，參考電極放在耳和鼻處，記錄標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)皮層誘發(fā)電位曲線N1-P1-N2，發(fā)現(xiàn)潛伏期明顯縮短，波寬顯著延長，此項檢查能在出現(xiàn)癥狀之前就檢測出神經(jīng)系統(tǒng)的異常。

3)血液動力學(xué)觀測

①背根神經(jīng)節(jié)和后爪血流量的研究：Yabuki使用雙通道激光多普勒流速計監(jiān)測血流，將血流量穩(wěn)定15min的恒定值作為基準(zhǔn)，每隔5min記錄一次，持續(xù)3h。發(fā)現(xiàn)髓核移植組背根神經(jīng)節(jié)和同側(cè)后爪的血流量明顯減少。

②血－神經(jīng)屏障的研究：采用EBA與Gd-DTPA的混合劑作為示蹤劑，通過MRI影像與熒光顯微鏡觀察神經(jīng)組織內(nèi)的分布情況，在受壓超過1個月時神經(jīng)根內(nèi)可見明顯的 EBA外滲現(xiàn)象。用HRP作為示蹤劑，在電鏡下可見受壓時間>1個月的神經(jīng)纖維內(nèi)膜腔存在HRP外滲現(xiàn)象，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接被破壞，出現(xiàn)HRP產(chǎn)物的胞飲小泡。跨細(xì)胞運輸示蹤劑的異?，F(xiàn)象表明血－神經(jīng)屏障的破壞導(dǎo)致了神經(jīng)根水腫的形成，但蛛網(wǎng)膜滲漏屏障未受到破壞。

4)生化檢測  采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定腦脊液中的蛋白標(biāo)記物，包括總蛋白、神經(jīng)絲蛋白輕鏈、S-100蛋白、神經(jīng)特異性烯醇酶和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維。在神經(jīng)根壓迫后1周，腦脊液中神經(jīng)絲蛋白和總蛋白的濃度明顯增高。腦脊液中的蛋白標(biāo)記物能靈敏反映神經(jīng)根受壓后軸突損傷在腦脊液中的生化改變，是有用的檢測手段。

5)分子生物學(xué)檢測

①炎性因子的基因表達(dá)：采用RT-PCR技術(shù)檢測炎性因子TNF，IL-1β，IL-6，IL-10的mRNA表達(dá)。可見壓迫術(shù)7d后IL-1β，IL-6mRNA明顯升高，術(shù)后14d TNF的基因表達(dá)顯著增高，術(shù)后1L-10表達(dá)持續(xù)升高，45d達(dá)高峰。認(rèn)為IL-1β、TNF可導(dǎo)致神經(jīng)纖維退變和脫髓鞘改變， IL-10與痛覺過敏的產(chǎn)生有關(guān)。

②神經(jīng)元細(xì)胞凋亡：神經(jīng)根受壓后由于瓦勒變性和逆行性退變，脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元的胞體可發(fā)生損傷反應(yīng)，出現(xiàn)潰變、死亡。已證明神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的死亡過程與程序性細(xì)胞死亡相同，脊髓運動神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元均可出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。

③GAP-43表達(dá)的變化：生長相關(guān)蛋白(GAP-43)是一種膜磷脂蛋白，富含于再生過程中的神經(jīng)元軸突與生長錐中，其消長的變化可作為判定周圍神經(jīng)損傷程度及再生速度的一項客觀指標(biāo)。周圍神經(jīng)無論是擠壓還是切斷性損傷之后，神經(jīng)元都能加速合成及轉(zhuǎn)運GAP-43，待神經(jīng)合成后便開始向下調(diào)控。研究表明，坐骨神經(jīng)壓榨傷后1～2周， GAP-43mRNA急劇升高，4周達(dá)高峰，7周恢復(fù)正常。

6)神經(jīng)行為觀測

①運動功能的觀察：采用肉眼觀察動物步態(tài)的方法，按功能障礙的程度不同分級。壓迫術(shù)后動物出現(xiàn)不同程度的垂足現(xiàn)象；用活動平板踏車測試動物行走持續(xù)時間，觀察在以2.4圈/s轉(zhuǎn)動以及每30s增加一倍轉(zhuǎn)速的轉(zhuǎn)桿上，記錄動物摔落的時間。神經(jīng)根受壓動物行走持續(xù)時間明顯下降。

②無害性熱刺激和機(jī)械疼痛刺激的定量測定：可采用50W熱輻射燈作為熱刺激源直接照射動物肢體，用秒表記錄肢體回縮反應(yīng)的潛伏期；用具有不同折彎強(qiáng)度的von Frey單纖維絲(0.976～46.54gf，克力)刺激動物肢體，當(dāng)某根單絲刺激肢體發(fā)生回縮反應(yīng)時，該單絲的折彎強(qiáng)度即為機(jī)械刺激強(qiáng)度值。比較兩側(cè)肢體，當(dāng)患側(cè)數(shù)值大于健側(cè)時，表示感覺減退。小于健側(cè)時，表示感覺過敏。動物壓迫術(shù)后出現(xiàn)熱覺過敏和機(jī)械覺減退的現(xiàn)象。