慶大霉素誘導腎小管間質(zhì)纖維化模型

(1)復制方法  體重200～260g成年大鼠，每天分2次經(jīng)皮下按400mg/kg體重劑量注射慶大霉素(Gentamicin,  GM)，連續(xù)2d。分別于次注射GM后2, 5, 8, 11, 15, 22, 29d收集大鼠尿液測24h尿量(UV)、尿肌酐(UCr)及尿鈉(UNa)，計算內(nèi)生肌酐清除率(CCr)和鈉排泄分數(shù)(FENa)；采血測定血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血鈉值(SNa)；麻醉處死動物分別留取腎臟，部分腎組織以10％甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，作連續(xù)組織切片，常規(guī)HE、PAS染色，光鏡下觀察。透射電鏡另取部分腎皮質(zhì)組織塊，經(jīng)2.5戊二醛-1.0鋨酸雙重固定，作透射電鏡切片，電鏡下觀察。

(2)模型特點  次注射GM后2日，模型動物24h后 UV開始增高，8d達峰值，之后下降，至第22日時恢復正常。模型動物尿蛋白逐漸增高，于第5日達高峰，持續(xù)至第8日之后逐漸下降，至第22日恢復正常；血肌酐(SGr)進行性增高，于第11日達峰值，后急劇下降，第15日恢復正常；注射 GM第2日血尿素氮(BUN)略有增高，第5日明顯升高，第8日、第11日達峰值后迅速下降，至第22日基本恢復正常；內(nèi)生肌酐清除率(CCr)第5日開始下降，第8日略有升高，之后持續(xù)下降，于第22日時降至低，至第29日基本恢復正常；鈉排泄分數(shù)(FENa)呈上升趨勢，至第15日達高峰，第22日開始下降，第29日基本降至正常水平。鏡下病理組織學觀察顯示，注射GM后6h，腎近曲小管上皮細胞刷狀緣部分脫離；第2日腎皮質(zhì)及外髓外帶出現(xiàn)灶性炎癥細胞浸潤，部分近曲小管上皮細胞腫脹、空泡變性，并見異常PAS陽性包含物聚集，刷狀緣部分脫失；第5日時腎皮質(zhì)內(nèi)近曲小管上皮細胞發(fā)生廣泛性壞死，管腔內(nèi)充滿紅色顆粒狀壞死物，可見蛋白管型，管壁未出現(xiàn)斷裂及塌陷現(xiàn)象，PAS染色基底膜保持完整，有少量近曲小管基底膜上開始覆有一層扁平的上皮細胞；第8、11日，管腔內(nèi)壞死物質(zhì)逐漸減少，近曲小管再生明顯，上皮細胞逐漸增多、增高，部分增生成乳頭樣突入管腔，可見有絲分裂象，PAS染色顯示刷狀緣逐漸增多；15d， EGF治療組形態(tài)接近對照組，僅在間質(zhì)內(nèi)見少量炎性細胞浸潤；第22日時腎小管管腔內(nèi)壞死物質(zhì)消失，其上皮細胞增生呈立方形，腎間質(zhì)仍可見少量炎癥細胞浸潤；第29日時模型動物腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復正常。模型制作過程中，腎遠曲小管、集合管上皮細胞可見空泡樣變性，但無壞死性改變，遠端腎單位中可見管型。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，注射 GM后2d時，模型動物腎近曲小管上皮細胞微絨毛大量脫失；胞質(zhì)內(nèi)次級吞噬體明顯增多，內(nèi)見大量大小不一髓樣小體，呈板層狀或帶狀，電子致密度高；線粒體腫脹且數(shù)量減少，基質(zhì)顆粒消失；細胞基底面質(zhì)膜內(nèi)褶變平且數(shù)量減少；5d時，腎近曲小管上皮細胞壞死，管腔內(nèi)充滿髓樣小體、細胞核及細胞器的膜性碎片；個別殘存的近曲小管上皮細胞內(nèi)有大量髓樣小體和少量殘存的腔面微絨毛；第8、11日，近曲小管表面開始覆蓋一層上皮細胞，腔面逐漸出現(xiàn)粗短的微絨毛，基底面質(zhì)膜內(nèi)褶逐漸增多；上皮細胞內(nèi)核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體逐漸增多，髓樣小體減少，線粒體數(shù)量有所增加；15d時，近曲小管上皮細胞腔面開始有吞飲小泡出現(xiàn)；22d時，腎近曲小管上皮細胞內(nèi)仍有少量髓樣小體；至第29日，動物超微結(jié)構(gòu)恢復正常。

(3)比較醫(yī)學  急性腎小管壞死(acute tubular necrosis, ATN)是臨床上ARF主要的病因，是臨床危重癥之一。慶大霉素(GM)作為治療革蘭陰性菌感染有效的氨基糖苷類抗生素應(yīng)用廣泛，但其對腎臟的毒性作用及導致 ATN或ARF的可能性不容忽視。本模型的致病機制是 GM在機體內(nèi)主要通過腎小球濾過而被清除，但濾過的一小部分(≤5％)可被近曲小管重吸收，與小管腔內(nèi)負電荷的刷狀緣結(jié)合，通過吞飲作用進入細胞，在近曲小管上皮細胞內(nèi)蓄積，含有GM的包涵小體被溶酶體吞噬并抑制各種膦酸脂酶活性，形成髓樣小體，髓樣小體形成是GM腎中毒的敏感指標；同時GM可抑制蛋白激酶C活性，引發(fā)線粒體等細胞器的正常代謝發(fā)生變化，導致腎小管出現(xiàn)毒性損傷。GM導致腎小管上皮細胞的壞死程度與劑量相關(guān)，低劑量GM造成近衄小管上皮細胞內(nèi)大量髓樣小體形成，但鏡下腎組織形態(tài)及腎功能無明顯變化；而較高劑量GM不僅可造成近曲小管嚴重損傷，還可使腎功能明顯損害。采用本方法誘導的 ATN模型，在壞死和恢復的過程中，既發(fā)生了腎小管的重吸收功能障礙又出現(xiàn)了腎小球濾過率的下降。腎小管對水鈉重吸收的減少抵消了腎小球濾過率下降所導致的原尿減少，因此模型具有多尿性腎功能衰竭特點。本模型制作方法簡單，耗費低廉，重復性好，可用于臨床上各種急性腎功能不全的實驗研究。